Jaký je recept na Lysis buffer?

Lýzový pufr je roztok používaný k rozbití nebo „lýze“ bakteriálních buněk a uvolnění intracelulárního obsahu. Je široce používán v molekulární biologii a mikrobiologických postupech, jako je extrakce DNA a proteinů. Přesné složení lyzačního pufru se může lišit v závislosti na konkrétní aplikaci a typu lýzovaných bakterií, ale typický recept obsahuje následující složky:

Tris-HCl (Tris(hydroxymethyl)aminomethan hydrochlorid): To působí jako pufrovací činidlo pro udržení pH pufru. pH lyzačního pufru je zásadní, protože může ovlivnit stabilitu a aktivitu enzymů zapojených do kroků.

EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová): EDTA je chelatační činidlo, které se váže na dvojmocné kationty, jako je hořčík (Mg2+) a vápník (Ca2+), které jsou nezbytné pro udržení integrity bakteriální buněčné stěny. Chelatací těchto iontů EDTA oslabuje buněčnou stěnu a usnadňuje buněčnou lýzu.

NaCl (chlorid sodný): NaCl je obsažen v pufru pro udržení osmotické rovnováhy a zachování strukturální integrity bakteriálních buněk. Vhodná koncentrace NaCl závisí na toleranci vůči solím konkrétních bakterií, které jsou lyžovány.

Detergent (např. SDS nebo Triton X-100): Detergenty jsou rozhodujícími složkami lyzačního pufru, protože narušují lipidovou dvojvrstvu bakteriální buněčné membrány. SDS (dodecylsulfát sodný) je běžně používaný detergent, ale lze použít i alternativy jako Triton X-100 nebo NP-40.

Lysozym: Lysozym je enzym, který specificky štěpí beta-1,4-glykosidické vazby přítomné v peptidoglykanové vrstvě bakteriálních buněčných stěn. Suplementace lysozymem v lyzačním pufru zvyšuje narušení buněk rozbitím peptidoglykanové sítě.

RNáza (ribonukleáza): Pokud je cílem extrakce RNA, lze do lyzačního pufru přidat RNázu, aby se zabránilo degradaci RNA během procesu lýzy. Enzymy RNázy degradují molekuly RNA štěpením fosfodiesterových vazeb.

Proteáza (Proteináza K): Pokud je cílem extrakce proteinu, může být do lyzačního pufru začleněna proteáza, jako je proteináza K. Proteináza K je robustní enzym, který dokáže trávit širokou škálu proteinů bez ovlivnění struktury nebo aktivity cílových proteinů, které nás zajímají.

Příprava zahrnuje rozpuštění příslušného množství Tris-HCl, EDTA, NaCl a vybraného detergentu v ultračisté nebo sterilní destilované vodě. Hodnota pH se poté upraví pomocí koncentrované kyseliny chlorovodíkové (HCl) nebo hydroxidu sodného (NaOH) na požadovanou hodnotu, typicky kolem pH 8,0. Lysozym, RNáza a proteináza K se přidají v doporučených koncentracích a roztok se důkladně promíchá, aby se zajistilo úplné rozpuštění všech složek.

Konečný lyzační pufr by měl být skladován za vhodných podmínek, obvykle -20 °C nebo -80 °C, aby se zachovala jeho stabilita a zabránilo se degradaci enzymů. Před použitím je třeba pufr rozmrazit a důkladně promíchat, aby byla zajištěna homogenita.

Je důležité optimalizovat složení lyzačního pufru na základě specifických bakterií, které jsou lyžovány, a následných aplikací. Úpravy pH, koncentrace detergentu nebo typů enzymů mohou být nezbytné pro dosažení účinné buněčné lýzy a zachování integrity cílových molekul.