Hvad er opskriften på Lysis buffer?

Lysebuffer er en opløsning, der bruges til at bryde op eller 'lyse' bakterieceller og frigive det intracellulære indhold. Det er meget udbredt i molekylærbiologi og mikrobiologiske procedurer, såsom DNA- og proteinekstraktion. Den nøjagtige sammensætning af lyseringsbuffer kan variere afhængigt af den specifikke anvendelse og typen af ​​bakterier, der lyseres, men en typisk opskrift omfatter følgende komponenter:

Tris-HCl (Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid): Dette fungerer som et buffermiddel til at opretholde bufferens pH. Lysebufferens pH er afgørende, da det kan påvirke stabiliteten og aktiviteten af ​​enzymer involveret i trin.

EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre): EDTA er et chelateringsmiddel, der binder til divalente kationer som magnesium (Mg2+) og calcium (Ca2+), som er essentielle for at opretholde integriteten af ​​bakteriecellevæggen. Ved at chelatere disse ioner svækker EDTA cellevæggen og letter cellelyse.

NaCl (natriumchlorid): NaCl er inkluderet i bufferen for at opretholde osmotisk balance og bevare bakteriecellernes strukturelle integritet. Den passende NaCl-koncentration afhænger af salttolerancen af ​​de specifikke bakterier, der lyseres.

Vaskemiddel (f.eks. SDS eller Triton X-100): Detergenter er afgørende komponenter i lysisbufferen, da de forstyrrer lipid-dobbeltlaget i bakteriecellemembranen. SDS (natriumdodecylsulfat) er et almindeligt brugt vaskemiddel, men alternativer som Triton X-100 eller NP-40 kan også bruges.

Lysozym: Lysozym er et enzym, der specifikt spalter de beta-1,4-glykosidiske bindinger, der er til stede i peptidoglycanlaget af bakterielle cellevægge. Lysozymtilskud i lysisbuffer øger celleforstyrrelser ved at nedbryde peptidoglycan-netværket.

RNase (ribonuklease): Hvis RNA-ekstraktion er målet, kan RNase tilsættes til lyseringsbufferen for at forhindre nedbrydning af RNA under lysisproceduren. RNase-enzymer nedbryder RNA-molekyler ved at spalte phosphodiester-bindingerne.

Protease (Proteinase K): Hvis proteinekstraktion er målet, kan en protease som Proteinase K inkorporeres i lysisbufferen. Proteinase K er et robust enzym, der kan fordøje en lang række proteiner uden at påvirke strukturen eller aktiviteten af ​​målproteiner af interesse.

Præparatet involverer opløsning af passende mængder af Tris-HCl, EDTA, NaCl og det valgte rengøringsmiddel i ultrarent eller sterilt destilleret vand. pH-værdien justeres derefter med koncentreret saltsyre (HCl) eller natriumhydroxid (NaOH) til den ønskede værdi, typisk omkring pH 8,0. Lysozym, RNase og Proteinase K tilsættes i de anbefalede koncentrationer, og opløsningen blandes grundigt for at sikre fuldstændig opløsning af alle komponenter.

Den endelige lysebuffer bør opbevares ved passende betingelser, sædvanligvis -20°C eller -80°C, for at bevare dens stabilitet og forhindre nedbrydning af enzymer. Før brug skal bufferen optøs og blandes grundigt for at sikre homogenitet.

Det er vigtigt at optimere sammensætningen af ​​lyseringsbufferen baseret på de specifikke bakterier, der lyseres, og de efterfølgende applikationer. Justering af pH, detergentkoncentration eller enzymtyper kan være nødvendige for at opnå effektiv cellelyse og bevare integriteten af ​​målmolekyler.