Qual é a receita do tampão Lysis?

Tampão de lise é uma solução usada para abrir ou 'lisar' células bacterianas, liberando o conteúdo intracelular. É amplamente utilizado em procedimentos de biologia molecular e microbiologia, como extração de DNA e proteínas. A composição exata do tampão de lise pode variar dependendo da aplicação específica e do tipo de bactéria que está sendo lisada, mas uma receita típica inclui os seguintes componentes:

Tris-HCl (cloridrato de tris(hidroximetil)aminometano): Isso atua como um agente tampão para manter o pH do tampão. O pH do tampão de lise é crucial, pois pode afetar a estabilidade e a atividade das enzimas envolvidas nas etapas de lise.

EDTA (ácido etilenodiaminotetracético): O EDTA é um agente quelante que se liga a cátions divalentes como magnésio (Mg2+) e cálcio (Ca2+), essenciais para manter a integridade da parede celular bacteriana. Ao quelar estes iões, o EDTA enfraquece a parede celular e facilita a lise celular.

NaCl (cloreto de sódio): O NaCl é incluído no tampão para manter o equilíbrio osmótico e preservar a integridade estrutural das células bacterianas. A concentração apropriada de NaCl depende da tolerância ao sal da bactéria específica que está sendo lisada.

Detergente (por exemplo, SDS ou Triton X-100): Os detergentes são componentes cruciais do tampão de lise, pois perturbam a bicamada lipídica da membrana celular bacteriana. SDS (dodecilsulfato de sódio) é um detergente comumente usado, mas alternativas como Triton X-100 ou NP-40 também podem ser usadas.

Lisozima: A lisozima é uma enzima que cliva especificamente as ligações beta-1,4-glicosídicas presentes na camada peptidoglicana das paredes celulares bacterianas. A suplementação de lisozima no tampão de lise aumenta a ruptura celular ao quebrar a rede de peptidoglicanos.

RNase (Ribonuclease): Se o objetivo for a extração de RNA, a RNase pode ser adicionada ao tampão de lise para evitar a degradação do RNA durante o procedimento de lise. As enzimas RNase degradam as moléculas de RNA clivando as ligações fosfodiéster.

Protease (Proteinase K): Se o objetivo for a extração de proteínas, uma protease como a Proteinase K pode ser incorporada no tampão de lise. A proteinase K é uma enzima robusta que pode digerir uma ampla gama de proteínas sem afetar a estrutura ou atividade das proteínas alvo de interesse.

A preparação envolve dissolver as quantidades apropriadas de Tris-HCl, EDTA, NaCl e o detergente selecionado em água destilada ultrapura ou estéril. O pH é então ajustado usando ácido clorídrico concentrado (HCl) ou hidróxido de sódio (NaOH) para o valor desejado, normalmente em torno de pH 8,0. Lisozima, RNase e Proteinase K são adicionadas nas concentrações recomendadas e a solução é bem misturada para garantir a dissolução completa de todos os componentes.

O tampão de lise final deve ser armazenado em condições apropriadas, geralmente -20°C ou -80°C, para manter a sua estabilidade e evitar a degradação das enzimas. Antes da utilização, o tampão deve ser descongelado e bem misturado para garantir a homogeneidade.

É importante otimizar a composição do tampão de lise com base nas bactérias específicas que estão sendo lisadas e nas aplicações a jusante. Podem ser necessários ajustes no pH, na concentração de detergente ou nos tipos de enzimas para obter uma lise celular eficiente e preservar a integridade das moléculas alvo.